水中微生物含量检测实验讲解

一、检测目的

通过监测井中水、饮用水或养殖舍内水中微生物的含量（包括菌落总数、大肠杆菌指数、沙门氏菌指数等），了解水卫生情况及鸡群饮水的动态变化，及时做好各种消毒措施，以保障饮用水的安生和卫生。

二、检测项目及定义

1、菌落总数：水样经过处理，通过在一定的培养基平板上生长的菌落数，来获得水中细菌总数。细菌总数是指lmL水中所含细菌菌落的总数，它反应了水样中活菌的数量。

2、大肠杆菌总数：是每1mL水中大肠杆菌总菌落数。

3、沙门氏菌总数：是每1mL水中沙门氏菌总菌落数。

4、金黄色葡萄球菌：是每1mL水中的金黄色葡萄球菌数目。

5、乳酸菌：是每1mL水中的乳酸菌数目。

三、实验试剂准备

1、营养琼脂：蛋白胨 10g、牛肉膏 3g、氯化钠 5g、琼脂粉 15g、蒸馏水 1000mL，121.3℃高压灭菌20min备用。成品商品培养基按说明书配置即可。

2、麦康凯琼脂：氯化钠5g、琼脂粉17g、蒸馏水1000mL、乳糖10g、0.01%结晶紫水溶液10mL、0.5%中性红水溶液5mL，121.3℃高压灭菌20min备用。成品商品培养基按说明书配置即可。

3、甘露醇氯化钠琼脂：蛋白胨10g、牛肉膏粉末1g、D-甘露醇10g、氯化钠75g、酚红0.025g、琼脂粉13g、蒸馏水1000ml，121.3℃高压灭菌20min备用。成品商品培养基按说明书配置即可。

4、SS琼脂：牛肉膏5g、脙胨5g、三号胆盐3.5g、琼脂17g、乳糖10g、柠檬酸钠8.5g、硫代硫酸钠8.5g、10%柠檬酸铁溶液10ml、1%中性红溶液2.5ml、0.1%煌绿溶液0.33ml、蒸馏水1000ml，121.3℃高压灭菌20min备用。成品商品培养基按说明书配置即可。

5、含CaCO3的GYP琼脂：葡萄糖10g/L，酵母膏10g/L，蛋白胨 g/L，牛肉膏 2g/L， NaAC·3H2O 2 g/L，微量元素液 5mL/L，吐温80溶液 10mL/L，CaCO3 5 g/L（180 ℃，干热灭菌30min后加入），琼脂 12g/L，pH 6.8，121℃ 15min。

注：1 mL微量元素液中含有：MgSO4·7H2O 40 mg，MnSO4·4H2O 2 mg，FeSO4·7H2O 2 mg，NaCl 2 mg。吐温80水溶液：50 mg/mL水溶液。

6、无菌生理盐水：氯化钠9g、蒸馏水1000ml，121.3℃高压灭菌20min备用。

四、实验器材准备

灭菌培养皿、100-1000µL移液器、灭菌的1000ul枪头、5ml、10ml注射器、灭菌15ml离心管、酒精灯、试管架、记号笔、恒温培养箱、超净工作台等。

五、实验开始准备

1、将待检样品、灭菌生理盐水、培养皿、注射器、移液器、15ml灭菌离心管、酒精灯、试管架、记号笔等实验物品（不拆封）放入超净工作台内，打开紫外线灯30min。

2、关闭紫外线灯，超净台向上拉至20cm处，手进入超净台后用酒精棉球擦拭整个手掌，点燃酒精灯，在酒精灯旁将离心管拆封放置在试管架上，用注射器吸取9ml灭菌生理盐水，依次加注到离心管当中（离心管数量为：样品数×2）。

六、样品稀释

将待检水样充分混匀用移液器吸取1ml，加入到盛有9ml灭菌生理盐水的离心管中，反复吹吸5次以上混匀后制成1:10的稀释液；再从1:10的稀释液中取1ml加入到盛有9ml无菌生理盐水的离心管中，反复吹吸5次以上混匀后制成1:100的稀释液。（本样品稀释到1:100，如样品污染严重或检测后菌落生长较多，可继续稀释检测。）

七、倾注法

1、在平板上分别标注养殖场名称、取水位置、培养基名称、稀释倍数。（一般稀释倍数标注1:10的稀释液用-1表示；1:100的稀释液用-2表示以此类推。）

2、将未稀释的样品、1:10的稀释液、1:100的稀释液分别用移液器吸取1ml加入到培养皿内。

3、空白对照：取1ml稀释用无菌生理盐水加注到培养皿内并做好标记。

4、取配置好的培养基，待温度降至45℃左右（以不烫手背又未出现凝集块为宜）快速倾注到标注与培养基名称相同的培养皿内。每个培养皿15ml-20ml，不易过薄或过厚。

5、空白对照培养皿内倾注相对应的培养基。

6、每个培养皿在倒完琼脂后均要在台面上延顺时针和逆时针各转3圈，以确保样品与培养基充分混匀。

7、待琼脂完全凝固后放入37℃恒温箱中倒置培养24-48h，观察结果，记录菌落数。

八、涂布法

1、将倒好培养基的培养皿用记号笔标记上养殖场名称、取水位置、稀释梯度、培养基名称。

2、用移液器按标记好的梯度每种培养基加入100µL样品到对应的培养皿中，用灭菌的涂布棒将其均匀涂开，涂好后放在超净台台面，使其充分吸收待检样品。

3、空白对照吸取100µL灭菌生理盐水用灭菌的涂布棒将其均匀涂开。

4、待液体完全吸收后，将培养皿放置37℃恒温箱中倒置培养24-48h，观察结果，记录菌落数。

九、菌落计数方法

1、选取菌落在30CFU-300CFU之间的稀释梯度平板计数；若最低稀释倍数菌落数仍低于30CFU的平板记录具体菌落数即可；若最高稀释倍数菌落数仍大于300CFU的可记录为多不可计，或数清菌落数计数；若连续2个稀释梯度菌落数均在30CFU-300CFU之间，则将这两个稀释梯度分别计数。

2、其中一个平板有较大片状菌落蔓延生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布均匀，可计算半个平板菌落数后乘以2，代表一个平板菌落。

3、当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。

4、营养琼脂计数培养皿内全部菌落；麦康凯琼脂只计数粉红或玫红色菌落，如图1； 甘露醇氯化钠琼脂只计数表面圆润光滑形态微小的金黄色菌落，如图2；SS琼脂只计数无色半透明有黑心的圆润微小菌落，如图3；含CaCO3的GYP琼脂只计数周围有透明圈的菌落，如图4。

图1

图2

图3

图4

5、若空白对照培养皿内长菌，则本次试验失败。

6、按以上方式计数菌落数量后乘以该培养皿中样品的稀释倍数记录结果；若每个稀释度都有平行试验的,应采用两个平板的平均数；若连续两个稀释梯度的菌落数均在30CFU-300CFU之间的，将分别计数的两个数值分别乘以相应的稀释倍数后，计算其平均值记录结果。

7、若使用涂布法,应将以上方法记录的数值乘以10做为最终记录结果。

十、结果与报告

菌落总数的报告：

1、菌落数小于100CFU时，按“四舍五入”原则修约，以整数报告。

2、若菌落数大于100个，则保留前两位，第三位四舍五入，以10的指数形式来表示。例如：168个则计数为1.7×10²；1686个则计数为1.7×10³。

3、水中微生物的计量单位为 CFU/g。例如1.7×10²CFU/g。

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